原理簡介
GFP、RFP等熒光蛋白因其的熒光性質和靈敏性，常作為報告基因研究并分析基因產物在細胞中的定位和相互作用等。將目標蛋白與熒光蛋白的N端或者C端融合，通過瞬時轉化技術或穩定遺傳轉化技術，使得該融合蛋白在受體材料細胞內表達，目標蛋白會牽引熒光蛋白一起定位到目標細胞器，通過顯微鏡觀察熒光蛋白在細胞內顯示的位置，確定目標蛋白的位置，從而確定目標蛋白的亞細胞定位情況。
為什么有的基因定位結果與預想的不一致？
對于一個特定的定位載體，只要熒光表達較好，其定位結果是確定的，不會隨人為意愿或操作而改變。至于有時候和預想的結果不一樣，可能和蛋白本身、選擇的表達載體以及熒光蛋白融合方式等有關。
為什么有的普通定位結果出來后無法準確判斷其定位位置？
細胞中的細胞器復雜且多樣，除一些常見的、特征比較明顯的細胞器外，有些細胞器在激光共聚焦下形狀比較相似，例如：線粒體、過氧化物酶體、高爾基體等細胞器，它們的熒光表達形狀可能都是點狀，因此不易區分。這時可以結合基因的其他功能研究來判斷其可能表達的位置。另外，蛋白表達本身也是一個復雜的過程，涉及到多個合成場所及轉運過程，自身表達情況可能比較復雜，因此不易判斷具體的表達位置。
亞細胞結構分離定位法
通過離心等技術分離各亞細胞結構，然后從分離物種進一步提取蛋白質，對目標蛋白質進行分析或檢測，從而獲得目標蛋白的定位。本方法適合研究某蛋白質組級別的細胞器定位，通常與雙向凝膠電泳分離和質譜技術相結合。
生物信息學預測
通過生物信息學手段，借助一些在線工具對蛋白的亞細胞定位信息進行預測，這種方法可以在短時間獲得大量蛋白的預測信息，不僅輔助于實驗，還能省時省力節約成本。
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